酵母菌隨著現代科技的發(fā)展，應用的范圍越來越廣泛，已經滲透到飼料、醫(yī)療、食品、化妝等諸多領域，在養(yǎng)殖領域，酵母菌源產品具有改善腸道消化吸收、促進動物生長、增強動物免疫力和抗應激力等作用，并且具有較強的誘食效果 ^[1-10]。隨著產業(yè)和加工技術的發(fā)展，相應產生的酵母衍生物越來越多，當種類繁雜的酵母源產品進入市場時，消費者只是根據產品簡介了解酵母產品的作用，不能直觀地區(qū)分出不同產品的特征。目前僅國標GB/T 22547-2008規(guī)定了酵母活細胞數的顯微檢測方法——次甲基藍法，但是對酵母類的其他產品，比如酵母細胞壁與酵母水解物，仍沒有鏡檢區(qū)分的標準。由于產品的結構與其發(fā)揮的生理功能是密不可分的，如果能夠用圖片的形式直觀地說明酵母源產品的結構，有助于使用者更好地明白酵母類產品的作用機理，更有針對性地使用這些產品。在已發(fā)表的文獻中，對酵母源產品形態(tài)特征方面鮮有論述，因此，有必要開展相關的研究。

本研究選取了市場上常見的具有代表性的幾種酵母源產品，選擇的依據主要是應用范圍較廣與效果較為明顯的產品種類，共選擇了4種產品，包括酵母水解物、酵母細胞壁、啤酒酵母粉和活性干酵母。酵母水解物氨基酸和小肽穩(wěn)定且具有高消化率，在動物的蛋白質營養(yǎng)方面具有顯著優(yōu)勢；酵母細胞壁作為高效免疫因子，可以直接食用；啤酒酵母粉為傳統的蛋白質飼料；活性干酵母是微生態(tài)制劑中常用的組分。試驗的主要目的是通過對染色方法進行改進，獲得酵母源產品較為清晰的顯微圖片及掃描電鏡圖片，并拍照記錄。通過對不同酵母源產品圖片的相互對比，描述其形態(tài)特征，從而明確區(qū)分不同酵母源產品的生理特性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1試劑與材料

酵母水解物、啤酒酵母粉、酵母細胞壁、活性干酵母，均由廣東雅琪生物技術有限公司微生物學實驗室提供。酵母水解物為采用糖蜜發(fā)酵生產后，經過自溶、酶解、噴霧干燥等工藝制成的黃色粉狀物，蛋白質含量不小于50%，水分含量不大于8.0%；啤酒酵母粉為啤酒酵母酵母泥干燥、粉碎制成的粉狀物，粗蛋白質含量為42.8%，水分含量不大于10.0%；將酵母水解物離心分離細胞內容物，留下的細胞壁經過干燥制成酵母細胞壁多糖，β-葡聚糖含量不小于20%，甘露寡糖含量不小于20%；活性干酵母（飼用高活性干酵母），白色短桿狀，酵母活細胞數≥200億個/g。

蒸餾水，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 PBS (pH=7.2)，2.5%戊二醛(5 mL 50%濃度的戊二醛，溶于95 mL PBS)，乙醇的梯度水溶液（濃度為30%，50%，70%，80%，90%），乙酸異戊酯，草酸銨結晶紫染液，碘液，95%酒精溶液，磷鉬酸染液，甲基綠。

1.1.2儀器與設備

Hitachi S-4800 Field Emission Scanning Electron Microscope掃描電鏡、普通光學顯微鏡、冷凍干燥機等。

1.2 試驗方法

1.2.1酵母源產品光鏡顯微觀察

（1）取樣品。對4種酵母源產品進行編號（1~4），每種樣品取1g，3個重復，并溶于20 mL蒸餾水中。

（2）制片。制作裝片之前，由于酵母源產品容易沉淀，首先對樣品進行攪拌混勻，再用膠頭滴管取少量樣品滴在玻片上，干燥固定。這一過程結束后，先對樣品進行一次觀察，并拍照記錄其形態(tài)。

（3）染色。在已經固定好的玻片上滴加草酸銨結晶紫染液1~2滴，染色1—2 min，水洗，除盡水滴。在玻片上滴加碘液，平放1—3 min，水洗。加95%酒精溶液脫色30—60 s，水洗。再用磷鉬酸染液復染5 min，用水沖洗后，最后用甲基綠染色1 min，水洗，風干后鏡檢^[11]。

（4）對比不同的試驗樣品，分別在不同放大倍數下進行觀察，選擇每組中相對較為清晰且具有代表性的圖片進行拍照記錄。

1.2.2酵母源產品的掃描電鏡觀察

（1）酵母源產品的前處理。①取樣。取0.5 g樣品，溶于10 mL 0.1 mol/L PBS (pH=7.2)，稍攪拌去除上清液，加入等量的PBS清洗三遍，清洗時每次添加清洗液要充分攪拌，保證菌體與清洗液的充分混合。②固定。2.5%戊二醛(5 mL 50%濃度的戊二醛，溶于95 mL PBS)，4 ℃固定3 h，之后用PBS清洗三次，每次10 min，具體的清洗步驟同①。③梯度脫水。用乙醇的水溶液分別按30%，50%，70%，80%，90%的濃度梯度對樣品進行脫水，每步15 min，之后在100%乙醇的水溶液中脫水2次，每次15 min,再將樣品置于乙醇和乙酸異戊酯1:1混合液中15 min，最后置樣品于乙酸異戊酯中15 min×2次，以徹底去除乙醇，保持細胞原有形態(tài)（若沒有乙酸異戊酯，可以叔丁醇替代）。④干燥保存。將處理好的樣品傾置于小培養(yǎng)皿中，置-80 ℃冰箱冷凍保存，之后放入冷凍干燥機中干燥，制成粉末狀，裝袋。

（2）酵母源產品的掃描電鏡觀察。

用Hitachi S-4800場發(fā)射掃描電鏡對樣品進行亞顯微觀察。樣品按照該掃描電鏡的操作規(guī)范進行處理。首先將經過預處理的樣品（呈粉末狀）撒到導電膠上，用吸耳球或高壓氮氣吹掃掉導電膠上未粘緊的樣品粉末。固定好后，對樣品進行噴金處理，使導電，再將制備好的樣品放到樣品室進行觀察，樣品室真空度小于 E-3 Pa。設定合適的加速高壓和發(fā)射電流。發(fā)射電流設為10 μA。選擇圖形信號及探測器類型為BSE，高度Z為5 mm。加高壓后對中并聚焦，在電腦顯示屏上即獲得顯微圖像。對整個酵母產品樣品表面進行觀察，掃描速度設定為Slow 3，選擇具有代表性的區(qū)域進行拍攝，并且在不同放大倍數下進行拍攝，以利于后期的圖片對比觀察。

2試驗結果與討論

2.1酵母源產品顯微圖片及分析

2.1.1 酵母源產品的直接光學顯微鏡觀察

就酵母的直接顯微觀察而言，圖1可見啤酒酵母粉能觀察到完整的酵母細胞，細胞呈分散狀，輪廓較為分明，能看到細胞壁、液泡等結構（圖1，黑色箭頭示）。對于酵母細胞壁產品（圖2），許多酵母細胞會傾向于粘結在一起呈團狀，幾乎無法看到完整細胞之間的界限。

由圖3活性干酵母和圖4酵母水解物對比觀察到，兩者酵母細胞基本保持了完整形態(tài)。活性干酵母細胞外表有光澤，形態(tài)飽滿，不透明，呈淡綠色。而酵母水解物個體明顯偏大，變薄，透光性高，顏色暗淡，可清晰看到酵母細胞內呈黑點狀的貯藏顆粒（圖4）。

2.1.2 酵母源產品的改良革蘭氏染色觀察

就酵母源產品的改良革蘭氏染色觀察而言，圖5顯示啤酒酵母粉的細胞溶解破裂，里面的內容物（淺藍色物質）析出（黑箭頭示）。而使用染色方法可以非常容易地區(qū)分出破裂的細胞壁組分（圖6，黑箭頭示圍繞在酵母細胞外的細胞壁組分）。酵母水解物細胞在顯微鏡下顯示淺綠色，透明，貯藏顆粒在細胞內呈黑點狀（圖8）。而活性干酵母細胞染色后呈深藍色（圖7），內部組織無法看清。

2.2酵母源產品的掃描電鏡圖片及分析

從酵母源產品的掃描電鏡可以看出，對于酵母水解物，可見細胞膜破裂溶解，顯露細胞內容物（圖9，白箭頭示）。而對于啤酒酵母細胞壁，則可見大量細胞壁成分堆疊在一起，酵母細胞僅剩下一個個變形的空殼，偶見一兩個略為完整的酵母細胞（圖10，白箭頭示）。就細胞形態(tài)而言，普通啤酒酵母粉細胞表面特征和活性干酵母差別不大（圖11，圖12），但是活性酵母細胞大小僅約4 μm，而啤酒酵母粉酵母細胞直徑約8~10 μm，差異明顯。兩種產品酵母細胞均有形成芽體的個體?！?/span>

3 討論

盡管酵母菌在自然界中存在的種類較多，但是在動物飼料領域實際利用開發(fā)的種類并不多。列入農業(yè)部最近三年發(fā)布的《飼料原料目錄》、《飼料原料目錄》修訂列表、《飼料添加劑品種目錄》飼料原料及添加劑目錄中的酵母源產品有：啤酒酵母粉、啤酒酵母泥、產朊假絲酵母蛋白、食用酵母、釀酒酵母水解物、釀酒酵母細胞壁、釀酒酵母提取物、釀酒酵母培養(yǎng)物、產朊假絲酵母和釀酒酵母。目前活性干酵母、啤酒酵母粉、酵母細胞壁等產品市場接納度相對較廣，使用也相對較多。本研究證實，這些產品能都擁有其較典型的形態(tài)特征，可在顯微鏡下辨別出來。

從形態(tài)觀察來看，簡單的用蒸餾水稀釋，可直接在顯微鏡下觀察出活性干酵母與啤酒酵母粉的細胞形態(tài)?；钚愿山湍革@得特別飽滿，外表有光澤，這也是酵母細胞的原本生物形態(tài)（圖3）；而啤酒酵母粉細胞喪失光澤，明顯干癟，透性增大（圖4）。這會是區(qū)分兩者的主要方法。這些形態(tài)特征也與它們在動物營養(yǎng)中的主要功能——改善腸道環(huán)境和作為蛋白源物質密切相關的。當然活性干酵母本身也可作為營養(yǎng)物質，已有大量的研究顯示，活性酵母能提高斷奶仔豬生產性能和免疫功能，改善奶牛瘤胃體外發(fā)酵特性，而啤酒酵母粉用于大菱鲆幼魚的飼養(yǎng)，可替代達17%的魚粉^[12-15]。

使用改良的革蘭氏染色方法，將革蘭氏染液第4液的稀釋沙黃液改為磷鉬酸液和甲基綠液，復染后酵母菌細胞壁被染成深綠色，細胞漿為藍紫色，在顯微鏡下易與其他成份區(qū)別。使用這種方法，對于酵母水解物與酵母細胞壁成分區(qū)別明顯，酵母水解物滲出的細胞內容物、細胞壁碎片清晰可辨（圖5，圖6）。到了掃描電鏡的放大倍數，這種區(qū)別更為明顯。酵母水解物可見細胞膜破裂溶解，顯露細胞內容物（圖9）。在這種情況下，動物分泌的消化酶能更容易地接觸酵母內部的營養(yǎng)物質，消化吸收率得到提高。在生產實踐上，酵母水解物可替代血漿蛋白粉在斷奶仔豬上使用^[16]，提高7~63日齡仔豬的日增重量^[17]。并且替代飼料中的魚粉可以提高凡納濱對蝦對飼料的消化機能^[18]。

而對于啤酒酵母細胞壁，則可見大量細胞壁成分堆疊在一起，酵母細胞僅剩下一個個變形的空殼（圖10），在普通光學顯微鏡下為成塊狀的細胞碎片結構（圖2，圖6）。這些散亂的細胞壁碎片，充當著信號分子的作用，被動物免疫細胞識別后，能很好地提升整個機體的免疫水平。啤酒酵母細胞壁作為一種免疫增強劑在母豬、蛋雞、異育銀鯽養(yǎng)殖上均有積極的效果^[19-21]。

本文所采用的4種實驗材料，均來自在畜禽養(yǎng)殖生產一線的商業(yè)化產品，這些產品有多年的市場應用實踐，能夠在一定程度上反映出市場上主流的酵母源生物飼料概況。由于在現實中尚無酵母源飼料的所謂“標準參考產品”（盡管酵母菌作為模式種對其形態(tài)特征已了解相對清楚），以這些試驗材料作為論述酵母源飼料的典型特征，可能不夠恰當。事實上關于酵母及其衍生物典型特征的報道非常少，商業(yè)市場仍處于初級階段，大多數從業(yè)者了解仍不透徹。

再從生產工藝上看，在制備酵母細胞壁成分時，需首先通過酶法或自溶法將酵母細胞破壁水解，再通過高速離心分離細胞內容物（這些細胞內容物經噴霧干燥后成為酵母精），即獲得細胞壁成分 ^[22]。因此從這個意義上說，細胞壁產品為酵母水解物的深加工產品。工業(yè)化的高速離心手段很難將體系中懸浮的所有酵母細胞都除去，因此造成了用普通光學顯微鏡觀察不同酵母組分產品時都能看到完整的酵母細胞。

因此，在判斷這些產品的質量時，不能僅依賴顯微鏡觀察，而應充分考慮其理化指標。比如，對于酵母水解物，粗蛋白質、氨基酸態(tài)氮、甘露聚糖和水分等是其強制性標識要求。而對于釀酒酵母細胞壁，甘露聚糖和水分是其強制性標識要求。消費者與企業(yè)質檢部門均需全面考慮以判斷產品質量。

目前我國農業(yè)部公告中允許使用的酵母類產品大部分都集中在釀酒酵母屬的種類，總體而言精細化加工程度是不高的，酵母類產品在農牧業(yè)的市場前景將非常廣闊，值得進一步工業(yè)化研究。

4 結論

（1）應用不同的染色方法和技術手段，在顯微鏡下區(qū)分出酵母水解物、酵母細胞壁、啤酒酵母粉（烘干）和活性干酵母這4種酵母源飼料產品是可行的。這4種產品均有各自明顯的形態(tài)特征，這些形態(tài)特征與其發(fā)揮的生理功能是密不可分的。

（2）在判斷酵母源產品的質量時，僅依賴顯微鏡觀察是不夠的，需根據不同產品，結合其不同的理化指標全面考慮。